Epigenome Editing
(dt. Epigenom-Veränderung oder Epigenom-Bearbeitung)
von Rolf Schosser, Biberach (2018)
Um den Begriff Epigenome Editing allgemeinverständlich zu erklären, müssen wir einen kurzen Blick auf die Begriffe Genom und Epigenom werfen. Es wird nicht ganz ohne fachchinesisch gehen, aber ich versuche möglichst bei verständlichen Bildern zu bleiben. Manches habe ich auch ziemlich vereinfacht.
Das Erbgut (Genom)
Das Genom ist die Gesamtheit der Erbanlagen (Gene) eines Lebewesens. Es besteht aus der Erbsubstanz DNA, Abkürzung für DeoxyriboNucleicAcid, deutsch Desoxyribonukleinsäure.
Die DNA besteht aus 4 Nukleinsäurebausteinen mit Adenin A, Thymin T, Cytosin C und Guanin G als Basen.
Diese Nukleinsäurebausteine legen sich zum DNA-Strang zusammen. Dieser DNA-Strang bildet aufgrund der Basenpaarung A-T, C-G einen Doppelstrang, in dem sich immer Adenin und Thymin bzw. Cytosin und Guanin gegenüber liegen.
Dieser Doppelstrang liegt als Doppelhelix vor, da diese räumliche Anordnung durch intramolekulare Wechselwirkungen besonders stabilisiert wird.
Die Doppelhelix wird zum Ablesen der Gene durch Enzyme lokal aufgetrennt.
Der Name Desoxynukleinsäure(acid) deutet darauf hin, dass die DNA negativ geladen ist.
Die negative Ladung sitzt auf den nach außen gerichteten Phosphatdiestern.
A, T, G und C sind die Buchstaben des genetischen Alphabets. Immer drei dieser Basen, also z.B TAG, GCT bilden ein Codon (sozusagen ein Wort) des genetischen Codes. Jedes Wort codiert für eine Aminosäure. Aus den 4 Buchstaben lassen sich 64 Wörter mit drei Buchstaben bilden. Da nur 20 Aminosäuren in der lebenden Zelle verwendet werden, werden mehrere Wörter (Codons) für eine Aminosäure verwendet. Dieser genetische Code ist im Wesentlichen für alle Lebewesen gleich.
Aus den 20 Aminosäuren, die durch den genetischen Code festgelegt sind, bauen die Lebewesen über mehrere Zwischenschritte sämtliche Proteine zusammen. Proteine, auch Eiweiß genannt, sind nicht nur Aufbaustoffe der Zelle, sondern auch sämtliche Enzyme, die Katalysatoren des Zellstoffwechsels, gehören dazu. Vereinfacht gesagt baut sich aus den Proteinen der gesamte Werkzeugkasten des Stoffwechsels auf und das Genom ist die Bauanleitung für diese Werkzeuge.
Packung des Erbguts
Der DNA-Strang liegt in der Zelle "gepackt" vor und wäre ungepackt zu lang für die Zelle bzw. den Zellkern, außerdem zu empfindlich.
Die gepackte DNA ist nicht ablesbar. Für die Gen-Expression muss die DNA entpackt werden, sowie der DNA-Doppelstrang lokal aufgespalten werden.
Bildlich kann man sich einen Zwirn vorstellen, der aus zwei Fäden zusammengedreht ist – die Doppelhelix. Dieser Zwirn bildet einen Strang oder ist zu einem Knäuel zusammengewickelt. Wenn ich an einem Wollknäuel an ein spezielles Fadenstück will, dass irgendwo mittendrin liegt, dann muss ich dieses Stück irgendwie aus dem Wollknäuel herausziehen oder das Wollknäuel aufrollen oder zumindest auflockern, und dann muss ich den Zwirn noch in die zwei Einzelfäden teilen.
Genau so sieht das im Erbgut aus. Die DNA wird zusammen mit 4 verschiedenen Histonen (Proteinen) zu Nukleosomen zusammengelagert. Je 146 Basenpaare der DNA bilden mit je 2 der 4, also 8 Histonen die Grundpackung. Diese Körper (Nukleosomen) werden durch ein weiteres Histon (Histon 1) über eine Histon1-DNA-Bindung zu höheren Einheiten zusammengelagert. Sehr viele dieser Einheiten werden beim Zellteilungsprozess zu den bekannten Chromosomen "kondensiert", ein Chromosom ist also ein vielfach gefalteter und zusammengewickelter DNA-Strang, von denen es nun in jeder höheren Zelle einige mit unterschiedlicher Funktion gibt. Bei Bakterien und anderen Zellen ohne Zellkern gibt es keine Chromosomen, da wird die DNA anders gepackt, aber das Prinzip ist ähnlich.
Epigenom – die Verfügbarkeit der Gene
Jede Zelle des menschlichen Körpers hat dieselben Gene, aber manche sind Haut- , andere Nieren- oder Nervenzellen geworden und diese ganzen Vorgänge werden in einem ersten Schritt dadurch geregelt, dass die selben Gene unterschiedlich abgelesen werden.
Mal ist die Zelle satt, mal ist sie hungrig, mal ist das ganze Wesen müde oder fit, mal will es sich fortpflanzen. Für jeden dieser Zustände benötigt die Zelle andere Mittel, andere Enzyme, Hormone etc. Wenn ich esse, produziert der Körpers alle möglichen Verdauungsenzyme, und wenn er zum Beispiel genügend Insulin produziert hat, dann muss er die Produktion auch wieder zurückfahren und diese Änderungen müssen sich laufend selbst regulieren. Wenn ich Sport mache, muss der Körper Energie zur Verfügung stellen, Herz und Gehirn müssen versorgt werden, usw. usf.
Das sind nur wenige Beispiele, wo eine Ablesung unserer Gene für die Zellfunktionen notwendig ist. Durch Änderung der Anforderungen oder der Umweltbedingungen wird sich der Bedarf für die Ablesung der Gene ändern, obwohl das Erbgut selbst immer gleich bleibt (von Mutationen abgesehen).
Epigenetik beschreibt „die strukturelle Anpassung chromosomaler Regionen, um veränderte Zustände der Aktivierung zu kodieren, zu signalisieren, oder zu konservieren" (Zitat Adrian Peter Bird, einer der Pioniere der Epigenetik) .
Die DNA-Methylierung ist die wichtigste epigenetische Veränderung.
Dabei werden an die Basen der Nukleinsäurebausteine Methylgruppen angehängt, um das Gen zu deaktivieren. Um das Gen zu aktivieren findet eine Demethylierung statt.
Bislang ist das für die Basen Cytosin und Adenin nachgewiesen. Bislang bekannt sind N6-Methyladenin, 6mA, 5-Methylcytosin, 5mC und N4-Methylcytosin, 4mC.
Histon-Modifikationen wurden bisher an den Enden der Histone, die aus den Nukleosomen herausragen, sowie auch im Bereich des Nukleosomenkerns gefunden. Man unterscheidet Histon-Acetylierung, Histon-Methylierung und Histon-Phosporylierung.
Histon-Acetylierung findet ausschließlich an Lysinen statt und neutralisiert die positive Ladung des Lysins. Dadurch verringert sich die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem Lysin und der DNA, was die Ablesbarkeit der DNA verbessert.
Histon-Methylierung und Histon-Phosphorylierung kommen an unterschiedlichen Aminosäurebestandteilen verschiedener Histon-Proteine vor und können die Ablesbarkeit positiv oder negativ beeinflussen, ja nach dem an welcher Stelle sie stattfinden.
Durch DNA-Methylierungen und Histon-Modifikationen wird die Ladungsverteilung und die räumliche Anordnung des DNA-Histon-Komplexes und der Chromosomenpackung modifiziert. Die Packung der DNA wird gelockert oder komprimiert und die DNA wird besser oder schlechter für die Ablesung der Gene zugänglich oder gesperrt. Das ist der zentrale Bestandteil der Epigenetik,
Das Epigenom ist die Abfolge der modifizierenenden Methyl, Acetyl- etc-Gruppen, die auf dem eigentlichen Genom als darüberliegendes Muster, als Abfolge von Lesbarkeit und Unlesbarkeit liegen. Als (noch hypothetischer) Epigenetischer Code wird die Gesamtheit der Ablesevorschriften einer Zelle bezeichnet. Über der eigentlichen genetischen Information liegt also praktisch eine Informationsebene, an welcher Stelle das Genom überhaupt abgelesen wird und an welcher Stelle nicht.
An einem Textbeispiel kann man sich das als Formatierungsabfolge vorstellen, mit der manche Buchstaben hervorgehoben (lesbar gemacht) und andere Buchstaben verborgen (unleserlich gemacht) werden.
Über dem folgenden Text liegt eine Formatierungsabfolge (das Epigenom), mit der aus einem längeren Basistext (dem Genom) nur die Buchstaben hervorgehoben werden, die den Satz "Das wird gelesen" bilden. Der Rest des darunterliegenden Textes ist unleserlich, er könnte aber durch eine Änderung der Formatierung wieder lesbar gemacht werden. Dieses einfache Beispiel dient nur zur Verdeutlichung, wie man zwei Informationsebenen – den Text und die Formatierung - so verknüpfen kann, dass etwas Neues herauskommt, ohne die ursprüngliche Information zu verändern, und ist in der Zelle natürlich komplexer.
Das Genom als Bibliothek der Zelle
Stellen wir uns das Genom als Bibliothek vor, in der eine Zelle als Grundbaustein der Lebewesen sämtliche Informationen vorfindet, wie sie ihre Lebensvorgänge bei wechselnden Lebensumständen regelt.
Jedes Chromosom ist dann ein Raum dieser Bibliothek.
In jedem Raum gibt es Regale mit Büchern, also Abschnitte des Chromosoms.
Die Bücher sind in diesem Bild die einzelnen Gene.
Die Regale sind das Gerüst des Chromosoms, in dem die eigentlichen Gene, also die Erbinformation, verteilt sind. Es gibt große Abschnitte des Genoms, die anscheinend nicht für Proteine codieren (also keine Erbinformation an sich enthalten) und deren Funktion noch unbekannt ist, die aber vermutlich dennoch wichtig für die Organisation des Genoms sind. Andere Abschnitte des Genoms sind ebenfalls selbst keine Gene, aber sie liegen direkt vor oder hinter Genen und zeigen dem Ableseapparat der Zelle an, wo z.B. ein Gen beginnt oder endet. Das sind bestimmte Abfolgen wie TATATA, da "weiß" das ablesende Enzym dass nach diesem Abschnitt der sinnvolle Teil beginnt.
Manche Bücherregale sind ins Register geschoben und gar nicht zugänglich.
In anderen Regalen sind Blenden vor einzelne Bücher geschoben, so dass man sie entweder gar nicht erkennt oder sie nicht aus dem Regal nehmen kann.
Andere kann man nicht ausleihen weil sie für jemanden vorgemerkt sind.
Also in dem Raum – dem Chromosom - sind vielleicht 10.000 Bücher – die Gene - in den Regalen, aber nur auf 1543 dieser Bücher kann ich im Augenblick zugreifen und sie lesen. Mit den anderen 8457 Büchern oder Genen in diesem Raum kann ich in diesem Moment nichts anfangen. (Anmerkung: 1543 + 8457 = 10000. Diese absoluten Zahlen sind von mir zur Verdeutlichung erfunden. Das menschliche Genom hat ca. 3 Milliarden Basenpaare. Die Schätzungen, für wie viele Gene diese 3 Milliarden Basenpaare stehen, reichen von ca. 19.000 bis etwa 153.000 Genen, es gibt sogar Wettbüros wo auf die richtige Anzahl gewettet werden kann. Andere Lebewesen haben mehr Gene als der Mensch, also die Größenordnung von 10000 Genen auf einem Chromosom ist denkbar, aber nicht absolut zu sehen. Auch, dass nur ein kleinerer Teil der Gene umgesetzt wird, ist nur von der Größenordnung her realistisch. Es gibt keine genauen Zahlen. Es geht darum, dass nur ein Teil der im Genom einer Zelle vorhandenen Information zu einem bestimmten Zeitpunkt verfügbar ist).
Oder, wenn ich auf das Bild von den Wollknäueln weiter oben zurückgreife – morgen sind manche Fadenstücke an ihren Platz im Inneren des Wollknäuels zurückgekehrt und andere Fadenstücke sind herausgezogen und aufgedröselt.
Diese Vergleiche hinken natürlich alle und ein Wissenschaftler schlägt die Hände über dem Kopf zusammen. Es geht nur darum wie so ein überlagertes Muster die Ablesbarkeit und Verfügbarkeit von Informationen regulieren kann, ohne die eigentliche Information zu verändern.
Und dieses Muster, welche Gene im Augenblick überhaupt abgelesen werden können, bildet das Epigenom.
Das Genom - also welche Bücher zu diesem Raum der Bibliothek gehören, oder auch das Wollknäuel – bleibt gleich. Aber wenn ich morgen wiederkomme, dann hat sich das Muster, welche Bücher ich lesen kann, eventuell trotzdem verändert. Regale sind aus den Registern gezogen, andere eingeschoben worden, die Blenden vor den Regalen sind verschoben, andere Bücher sind freigegeben oder gesperrt worden. Das Genom ist gleich geblieben, das Epigenom hat sich verändert.
Die Ablesbarkeit des Genoms – des gesamten Erbguts – hat sich dadurch verändert, es kommen andere Gene zum Tragen als vorher.
In der lebenden Zelle finden solche Veränderungen nicht nur in Tagen, sondern teilweise in Bruchteilen von Sekunden statt und die eigentlichen Vorgänge sind natürlich auch etwas anders.
Das Epigenom wird über Rückkopplung und Selbstregulation der Zelle, aber auch durch äußere Einflüsse wie z.B. Mangelzustände und Überfluss oder auch schädliche Chemikalien sowie vermutlich auch durch Traumata beeinflusst. Wobei diese Einflüsse ineinandergreifen, Mangel und Selbstregulation z.B.
Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung sind Teile dieses selbstregulatorischen Prozesses, der z.B. dafür sorgt dass die Synthese eine Proteins auch wieder gestoppt wird, wenn genügend davon vorhanden ist.
Zum Teil werden Veränderungen am Epigenom auch an die Nachkommen vererbt. Beim Mais ist die teilweise Vererbbarkeit der Methylierung relativ gesichert, beim Menschen dagegen umstritten. In diesem Bereich wird intensiv geforscht.
Epigenome Editing – gezielte Änderung der Ablesbarkeit des Genoms
Die DNA muss für die CRISPR-Verfahren - clustered regularly interspaced, short
palindromic repeats – ebenfalls epigenetisch vorbereitet werden. Der Werkzeugkasten für diese Vorbereitung liegt in Bakterienzellen bereits auf natürlichem Wege vor. Deshalb können die beteiligten Enzyme auch für weitere Epigenomveränderungen nutzbar gemacht werden.
Epigenome Editing, Epigenom-Veränderung zielt darauf ab die DNA durch Änderung der Ablesbarkeit besser manipulierbar zu machen oder die Ablesung als solche zu beeinflussen. Außerdem dient es Forschungszwecken, indem man durch gezielte An- und Abschaltung die Auswirkungen einzelner Gene bestimmen will.
In den Anfangszeiten der genetischen Forschung hatte man die Hoffnung, dass Krankheiten nur durch einzelne Gene verursacht werden. Inzwischen weiss man, dass in vielen Fällen mehrere Gene und Umwelteinflüsse zusammenspielen müssen, damit aus einer Disposition eine manifeste Erkrankung wird. Für die Erforschung dieser Erkrankungen braucht man Methoden, die relativ viele Gene leicht an- und ausschalten können.
Aber genau so braucht man diese Forschungen natürlich auch, um genveränderte Tiere oder Pflanzen mit bestimmten Eigenschaften zu erzeugen, die ja auch wieder auf verschiedenen Genen oder einem bestimmten Epigenommuster beruhen.
Dafür werden verschiedene Protein-Gruppen verwendet, die diese chemischen DNA-Veränderungen beeinflussen.
Da die Modifikationen, Methylierung etc. zu unspezifisch sind und an verschiedenen Stellen des Genoms oder in unterschiedlichen Zellzuständen bzw der Zellregulation auch unterschiedlich wirken, müssen die Epigenom-verändernden Proteine an die gewünschten DNA-Abschnitte gebracht werden. Die Zielproteine haben dafür Abschnitte, die an entsprechende DNA-Abschnitte andocken.
Das betrifft z.B. die Primer-Abschnitte, an denen die Ablesung eines Gens beginnt. Also das Protein erkennt den Primer-Abschnitt der DNA, die TATA-Box.
Verwendet werden z.B. TALE - Transcription Activator-Like Effector Protein oder Zinkfinger-Proteine. Diese Methoden waren die ersten noch mühsamen Versuche, das Epigenom zu verändern.
Heute ist es durch das Crispr-Cas9-Verfahren wesentlich einfacher geworden.
CRISPR-Cas9 wird ebenfalls benutzt, um Proteine an die DNA zu binden, die die DNA-Aktivität beeinflussen. Cas9 ist eine Endonuklease, d.h. ein Enzym, welches die DNA schneiden kann. Man verwendet statt Cas9 das mutierte dCas9, das durch 2 Punktmutationen seine katalytische Schneidefähigkeit eingebüßt hat, aber trotzdem an die DNA bindet. Z. B. wird das Enzym DNA (cytosin-5)-methyltransferase 3A mit dem Protein dCas9 fusioniert, um damit eine Zielregion der DNA zu methylieren, die durch eine spezifische Leit-RNA adressiert wird.
Die Leit-(Guide-) RNA besteht aus einer Kombination von crRNA:tracrRNA
Die tracrRNA ist immer gleich und bildet die Kopplung an das (d)Cas9-Protein.
Die crRNA enthält die Variable Zielsequenz...also praktisch die Stücke Virencode aus denen die CRISPR-Bibliothek besteht. Dieser Abschnitt kann auch durch eine künstlich hergestellte RNA ersetzt werden, um das dCas9-Protein an beliebige DNA-Abschnitte zu lenken.
Mit dieser Methode wird dann die DNA an dieser Stelle blockiert oder freigegeben, so dass ein bestimmtes Gen abgelesen werden kann oder auch nicht. Das Gen kommt also zum tragen oder auch nicht, je nachdem was gewünscht ist, so das man seine Funktion bestimmen oder seine Wirksamkeit beeinflussen kann, ohne direkt in das Genom einzugreifen.
Wenn wir bei dem Bild der Bibliothek bleiben, könnte man die Ablesbarkeit sogar über die Zeit verändern und Änderungen auch rückgängig machen. Da dieser ganze Prozess wie alle CRISPR-Verfahren aber durchaus eine relevante Fehlerquote hat, so dass andere Gene getroffen werden oder andere unerwünschte Effekte auftreten, ist das ganze Verfahren auch mit Risiken verbunden. Diese Risiken bestehen einerseits darin, dass der gewünschte Effekt mit einigen Prozent Wahrscheinlichkeit nicht erreicht wird, und andererseits darin, dass unerwünschte oder schädliche Effekte ebenfalls mit einigen Prozent Wahrscheinlichkeit auftreten. Das betrifft Anwendungen am Menschen genau so wie die Freisetzung dadurch veränderter Lebewesen in der Landwirtschaft oder Natur. Bis zu einer sicheren Anwendung in gesundheitsrelevanten Bereichen ist es außer bei lebensbedrohlichen Erkrankungen, wo das Risiko einer neuen Therapie eine geringere Rolle spielt, noch ein weiter Weg.